2-8℃避光

1.有效期為試劑盒未拆封前按要求條件保存的有效期。
2.試劑拆封后請盡快使用完！

3個(gè)月（注意：里面的孵育液是一次性配完，一周內(nèi)有效！）

顯微鏡

1. 石蠟切片
2. 冰凍切片
3. 細(xì)胞涂片，爬片
4.血涂片等

1光學(xué)顯微鏡
2.染缸
3.移液器
4.秒表
5.冰盒

純水

1.載玻片
2.吸頭
3.一次性手套

1.TRAP孵育液易失效，本法宜用皮膚穿刺血涂片，晾干后應(yīng)及時(shí)染色；
2.對冰凍切片染色時(shí)，應(yīng)減少切片在室溫暴露的時(shí)間。
3.樣本需新鮮，取材后應(yīng)立即處理，否則會影響酶的活性。
4.組織固定需在4℃冰箱進(jìn)行，時(shí)間不宜超過24h，否則酶活性會減弱或消失。
5.一般不建議用石蠟切片。如果需要用石蠟切片，組織在石蠟包埋時(shí)，溫度不宜高于56℃。應(yīng)使用熔點(diǎn)為52～54℃的石蠟進(jìn)行浸蠟，浸蠟時(shí)間要短，否則酶活性會減弱或消失。
6.石蠟切片不需要固定。

（注意：里面的孵育液是一次性配完，一周內(nèi)有效！）
注意：其他工作液請使用前新鮮配制，配制后立即使用，一次使用完，不可放置。

樣本的染色處理：
一、血涂片及骨髓涂片
1、推片：
取全血或骨髓3ul左右置載玻片上，將推玻片保持與載玻片30°角，置于血滴正前方，稍微往后移與血滴接觸，血滴沿推片下緣散開，再勻速沿載玻片平面平穩(wěn)向前滑動，至血滴鋪完血膜為止。不要太薄，以免細(xì)胞太少，也不要太厚，以免太重疊。
2、固定：
讓涂片在空氣中自然晾干，再放入本試劑盒中的固定液A中固定2-3分鐘，水洗30-60秒。
3、孵育：
水洗后還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會變差。
4、復(fù)染：
孵育完后，取出水洗1分鐘，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染。可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘，兩者任選其一即可。

二、細(xì)胞涂片及細(xì)胞爬片
1、固定：
將細(xì)胞涂片或細(xì)胞爬片放入本試劑盒中的固定液A中固定2-3分鐘，水洗30-60秒。
2、孵育：
水洗后還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會變差。
3、復(fù)染：
孵育完后，取出水洗1分鐘，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染。可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘，兩者任選其一即可。

三、冰凍切片
1、回溫：
將保存在-20℃冰箱中的冰凍切片放置到切片架上回溫5-10分鐘。可以放在37℃孵箱中進(jìn)行回溫，或者將切片架放置在一個(gè)小盒子中，將盒子置于37℃水浴鍋中進(jìn)行回溫。
2、水合：
將回溫好的切片，水中浸泡1-2分鐘。
3、固定：
讓切片在空氣中自然晾干，再放入本試劑盒中的固定液中固定2-3分鐘，水洗30-60秒。
4、孵育：
水洗后還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會變差。
5、復(fù)染：
孵育完后，取出水洗1分鐘，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染。可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘，兩者任選其一即可。

四、石蠟切片
1、脫蠟：
二甲苯中脫蠟5-10分鐘。再換用新鮮的二甲苯脫蠟5-10分鐘。
2、浸泡：
無水乙醇浸泡5分鐘。再分別用90%、70%乙醇各2分鐘。
3、水合：
蒸餾水中浸泡2分鐘。
4、孵育：
還未干前放入底物孵育液中避光孵育60分鐘。太干后染色效果會變差。
5、復(fù)染：
孵育完后，取出水洗1分鐘，在玻片未干前進(jìn)行復(fù)染。可用蘇木素復(fù)染1-2分鐘，或者用甲基綠復(fù)染2-3分鐘，兩者任選其一即可。

結(jié)果分析：
陽性反應(yīng)為鮮紅色或深紅色顆粒，定位于胞漿中。

1細(xì)胞誘導(dǎo)不成功？
細(xì)胞系或原代BMM細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞因子的質(zhì)量很重要。誘導(dǎo)效果不好時(shí)可以考慮調(diào)整誘導(dǎo)條件，提高RANKL濃度或者嘗試是否添加M-CSF。

2.如何判斷陽性細(xì)胞？
一般不通過形態(tài)變化說明，RAW細(xì)胞非常形態(tài)非常多樣，形態(tài)變化并不能說明問題。一般認(rèn)為多核加上TRAP陽性才能說是多核破骨細(xì)胞。

1.Guiping Chen et al.
Bergapten suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and ovariectomy-induced osteoporosis via suppression of NF-κB and JNK signaling pathways
Biochemical and Biophysical Research Communications 2019

2.Wen?Yong Fei et al.
Magnolol prevents ovariectomy?induced bone loss by suppressing osteoclastogenesis via inhibition of the nuclear factor?κB and mitogen?activated protein kinase pathways
International Journal of Molecular Medicine 2019