Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明

一、核心檢測(cè)原理

• Annexin V：一種鈣依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，可高特異性、高親和力地與膜外 PS 結(jié)合，通過(guò)熒光標(biāo)記（如 FITC，異硫氰酸熒光素）實(shí)現(xiàn)對(duì)凋亡早期細(xì)胞的識(shí)別。
• PI（碘化丙啶）：一種核酸染料，無(wú)法透過(guò)完整細(xì)胞膜，但可進(jìn)入膜破損的細(xì)胞（如凋亡晚期細(xì)胞或壞死細(xì)胞），與 DNA 結(jié)合發(fā)出紅色熒光，用于區(qū)分凋亡晚期 / 壞死細(xì)胞與活細(xì)胞、凋亡早期細(xì)胞。

• 活細(xì)胞：Annexin V?/PI?（無(wú)熒光）
• 凋亡早期細(xì)胞：Annexin V?/PI?（僅綠色熒光）
• 凋亡晚期細(xì)胞：Annexin V?/PI?（綠色 + 紅色熒光）
• 壞死細(xì)胞：Annexin V?/PI?（僅紅色熒光，膜完整性早于凋亡被破壞）

二、試劑盒組成（典型配置）

1. Annexin V-FITC：熒光標(biāo)記的 Annexin V，通常溶于含防腐劑的緩沖液中，避光保存。
2. PI 染色液：高濃度 PI 溶液（需稀釋使用），具有潛在毒性和誘變作用，操作時(shí)需注意防護(hù)。
3. Binding Buffer：含鈣離子的緩沖液，維持 Annexin V 與 PS 結(jié)合所需的離子環(huán)境，避免使用無(wú)鈣緩沖液（如 PBS）替代。
4. 說(shuō)明書(shū)：包含具體稀釋比例、染色時(shí)間、操作步驟及注意事項(xiàng)。

三、實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵步驟

1. 細(xì)胞收集：貼壁細(xì)胞需用胰酶消化（避免過(guò)度消化導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷），懸浮細(xì)胞直接離心收集，用冷 PBS 洗滌 2 次以去除培養(yǎng)基成分。
2. 洗滌與重懸：將細(xì)胞重懸于 Binding Buffer 中，調(diào)整濃度至 1×10? cells/mL，確保細(xì)胞狀態(tài)良好（避免機(jī)械損傷導(dǎo)致的假陽(yáng)性）。
3. 雙染反應(yīng)：每 100μL 細(xì)胞懸液中加入 5μL Annexin V-FITC 和 5μL PI，室溫避光孵育 5-15 分鐘（時(shí)間過(guò)短可能染色不充分，過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致 PI 非特異性進(jìn)入活細(xì)胞）。
4. 檢測(cè)：
   • 流式細(xì)胞術(shù)：孵育后加入 400μL Binding Buffer，1 小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，F(xiàn)ITC 檢測(cè)通道為 FL1（綠色熒光），PI 檢測(cè)通道為 FL2 或 FL3（紅色熒光）。
   • 熒光顯微鏡：滴加染色后的細(xì)胞懸液至載玻片，封片后觀察，凋亡早期細(xì)胞呈綠色，凋亡晚期細(xì)胞呈黃橙色，壞死細(xì)胞呈紅色。

四、應(yīng)用場(chǎng)景

• 基礎(chǔ)研究：探究藥物、輻射、細(xì)胞因子等對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)或抑制作用。
• 臨床檢測(cè)：評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，監(jiān)測(cè)免疫細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。
• 毒理學(xué)研究：檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞的毒性及凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

五、注意事項(xiàng)

1. 避光操作：FITC 和 PI 均易受光漂白，染色及孵育過(guò)程需避光，流式檢測(cè)前樣本需置于冰上并盡快上機(jī)。
2. 鈣離子依賴(lài)：Binding Buffer 中的鈣離子是 Annexin V 結(jié)合 PS 的關(guān)鍵，若緩沖液含鈣量不足，會(huì)導(dǎo)致染色效率下降。
3. 細(xì)胞濃度：過(guò)高的細(xì)胞濃度可能導(dǎo)致熒光信號(hào)疊加，影響結(jié)果分析，建議調(diào)整至 1×10? cells/mL 左右。
4. 對(duì)照設(shè)置：需設(shè)置空白對(duì)照（未染色細(xì)胞）、單染對(duì)照（僅 Annexin V-FITC 或 PI）用于流式細(xì)胞術(shù)的熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)。