2-8℃ 避光

開(kāi)蓋后組份按要求條件保存。

6個(gè)月

分光光度計(jì)

血漿/組織/細(xì)胞

分光光度計(jì)

1.分光光度計(jì)（對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀）
2.恒溫水浴鍋
3.低溫離心機(jī)
4.電子天平
5.勻漿器或研缽
6.移液器
7.冰盒

1.PBS緩沖液
2.純水

1.比色皿
2.試管
3.吸頭
4.一次性手套

1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
2.建議次測(cè)定時(shí)先做2-3個(gè)樣品的本底對(duì)照（空白對(duì)照），如果樣本空白對(duì)照與空白管非常接近，則說(shuō)明樣品液中不存在干擾物質(zhì)，可以不再檢測(cè)樣本本底對(duì)照；如果樣品空白對(duì)照與空白管有顯著差異，則在測(cè)定每個(gè)樣本時(shí)都需要做樣本的空白對(duì)照；
3.GSH比較穩(wěn)定，血液樣本以ACD抗凝后冰箱4℃保存，3周內(nèi)穩(wěn)定。
4.請(qǐng)盡量使用新鮮的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，而不要使用凍存的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，避免使酶活性下降。
5.輕度溶血樣本對(duì)GSH測(cè)定無(wú)影響。
6.全血GSH與吸煙和鍛煉成正比。 與乙醇節(jié)制程度成反比。成年人全血GSH的參考區(qū)間為1.02±0.17mmol/L
7.測(cè)定各孔時(shí)，各孔溫度均需達(dá)到室溫或25℃，否則影響結(jié)果。
8.測(cè)定時(shí)建議使用412nm，亦可選用405~425nm；
9.動(dòng)物樣品不能立即測(cè)定，應(yīng)先加入GSH提取液勻漿處理，沉淀后去除蛋白質(zhì)，防止蛋白質(zhì)所含巰基及相關(guān)酶對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。處理后的提取液可放低溫冰箱-70℃保存，10天內(nèi)有效。
10.為了您的安全和nm健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

1. 配制GSH提取液（1x）：
取一份GSH提取液（3X）加入2份純水，混勻即可；
2. 配制DTNB顯色液：量取50mlDTNB稀釋液加入80mgDTNB粉末中，充分溶解即為DTNB顯色液；也可使用精密天平稱取DTNB粉末，配制成終濃度為1.6%的DTNB顯色液；配置好的DTNB顯色液2-8℃保存，有效期一個(gè)月。現(xiàn)配現(xiàn)用。
3. 配制GSH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：
將GSH標(biāo)準(zhǔn)（1mM）用純水稀釋成0.1mM的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，即GSH標(biāo)準(zhǔn)（100uM），然后按下表一次加入純水，GSH檢測(cè)緩沖液和DTNB顯色液，混勻，25℃保溫反應(yīng)10min。以0號(hào)管調(diào)零，用分光光度計(jì)412nm測(cè)定各管的吸光度值，以GSH的濃度（uM）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4. 樣品準(zhǔn)備：
a) 紅細(xì)胞或血漿樣品的制備：
請(qǐng)盡量使用新鮮的血液進(jìn)行測(cè)定。
600r/min離心10分鐘，沉淀為紅細(xì)胞，上清為血漿。
對(duì)于紅細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。取約50ul紅細(xì)胞沉淀或血漿，加入50ulGSH提取液（1x），充分Vortex振勻。冰浴放置30min，4℃，12000r/min離心20min，取上清用于還原型(GSH)測(cè)定。
處理好的紅細(xì)胞樣品最后需用GSH提取液（1x）稀釋10倍后進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)；
對(duì)于血漿樣品，應(yīng)直接取樣進(jìn)行檢測(cè)。
b) 動(dòng)物組織樣品的制備：
稱取0.2g樣本于研缽中，加入1ml經(jīng)4℃預(yù)冷的GSH提取液（1x），冰浴條件下研磨勻漿后， 4℃，12000r/min 離心20min，取上清用于還原型(GSH)測(cè)定。 并記錄上清液的總體積。也可以用液氮研磨勻漿。

c) 細(xì)胞樣品的制備：
PBS洗滌細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入細(xì)胞沉淀3倍體積的GSH提取液（1x），充分Vortex振勻。(收集細(xì)胞前后分別對(duì)離心管進(jìn)行稱重，從而就可以計(jì)算出細(xì)胞沉淀的重量，10mg細(xì)胞沉淀的體積可以粗略地看做10ul。)對(duì)樣品進(jìn)行快速的凍融后，4℃或冰上孵育5分鐘。4℃，12000r/min 離心20min，取上清用于還原型(GSH)測(cè)定。

5. GSH加樣操作：
取5ml一次性離心管，按照下表依次加入試劑，混勻并注意避免產(chǎn)生氣泡。25℃保溫反應(yīng)10min。1cm比色杯，以空白孔調(diào)零，用分光光度計(jì)412nm測(cè)定各管的吸光度值。
如果樣品中的GSH濃度過(guò)高，可減少樣品用量或者用GSH提取液（1x）適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

6．計(jì)算：
根據(jù)還原型（GSH）標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的吸光度值（樣品測(cè)定孔吸光值-空白對(duì)照吸光值），可計(jì)算出樣品中GSH的濃度（umol/L）和含量（umol/g）

組織細(xì)胞樣品GSH（umol/g）=C x VT x N /W

式中：
C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的GSH濃度（umol/L）
VT為提取液的總體積（L）
W為樣品的質(zhì)量（g）
N為稀釋倍數(shù)

1.Xiaobin Li et al.
Astaxanthin reduces type 2 diabetic?associated cognitive decline in rats via activation of PI3K/Akt and attenuation of oxidative stress
Molecular Medicine Reports 2015