囊泡是由細(xì)胞膜包裹形成的微小膜性結(jié)構(gòu)，廣泛存在于生物體液(血液、尿液、腦脊液)及培養(yǎng)液中，根據(jù)來源可分為外泌體(30-150nm)、微囊泡(100-1000nm)和凋亡小體(50-2000nm)。其內(nèi)含DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，在疾病診斷、藥物遞送等領(lǐng)域具有重要價(jià)值。本文系統(tǒng)闡述從樣本采集到最終產(chǎn)物鑒定的完整技術(shù)鏈條。

　　一、前期準(zhǔn)備與樣本處理

　　1. 材料選擇原則

　　- 生物源性樣本：優(yōu)先選用新鮮未溶血血漿(抗凝劑推薦枸櫞酸鈉)，避免使用EDTA可能干擾后續(xù)質(zhì)譜分析。細(xì)胞培養(yǎng)上清需提前4℃靜置去除死細(xì)胞碎片。

　　- 合成型囊泡：通過基因編輯細(xì)胞系構(gòu)建，注意添加無外泌體血清替代品。

　　- 特殊樣本：腦脊液需經(jīng)蔗糖梯度預(yù)純化，尿液樣本應(yīng)濃縮處理。

　　2. 預(yù)處理關(guān)鍵步驟

　　- 初步澄清：將原始樣本以300×g離心10分鐘去除完整細(xì)胞；再以2000×g離心20分鐘清除凋亡體。

　　- 過濾除菌：采用0.8μm濾膜截留大顆粒雜質(zhì)，保留小于該孔徑的目標(biāo)囊泡。

　　- 濃縮富集：對(duì)于低豐度樣本，可先用超濾管(MWCO 10kDa)進(jìn)行體積縮減。

　　二、質(zhì)量控制體系構(gòu)建

　　1. 表征分析組合拳

　　- 粒徑分布：納米粒子追蹤儀(NTA)顯示峰值應(yīng)在標(biāo)稱范圍內(nèi)，PDI<0.2表明均一性好。

　　- 形態(tài)觀察：透射電鏡下可見典型杯狀凹陷結(jié)構(gòu)，冷凍蝕刻技術(shù)揭示膜層數(shù)。

　　- 標(biāo)志物驗(yàn)證：Western blot檢測(cè)CD63、TSG101陽性，Calnexin陰性排除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)污染。

　　- 功能檢測(cè)：熒光染料標(biāo)記示蹤顯示被靶細(xì)胞攝取效率>60%。

　　三、進(jìn)階優(yōu)化策略

　　1. 產(chǎn)量提升技巧

　　- 刺激誘導(dǎo)分泌：對(duì)腫瘤細(xì)胞施加缺氧/輻射應(yīng)激，可使囊泡釋放量提高5-8倍。

　　- 連續(xù)收集模式：每48小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，累計(jì)收獲周期延長(zhǎng)至7天。

　　- 切向流過濾系統(tǒng)：配備中空纖維膜包，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)連續(xù)置換緩沖液。

　　2. 純度強(qiáng)化方案

　　- 雙抗體夾心法：先用過抗CD9抗體包被磁珠捕獲泛囊泡，再用EpCAM抗體二次篩選特定亞群。

　　- 仿生親和層析：修飾瓊脂糖珠表面為磷脂雙層膜，模擬天然相互作用捕獲目標(biāo)囊泡。

　　- 電荷排斥層析：利用肝素瓊脂糖柱吸附帶負(fù)電的雜蛋白，流出相富集目標(biāo)囊泡。

　　四、儲(chǔ)存運(yùn)輸規(guī)范

　　- 短期保存：4℃條件下不超過72小時(shí)，置于硅烷化EP管減少吸附損失。

　　- 長(zhǎng)期存儲(chǔ)：分裝后-80℃凍存，禁止反復(fù)凍融超過3次。推薦添加海藻糖作為凍干保護(hù)劑。

　　- 運(yùn)輸要求：冰袋維持0-4℃，全程避光防震，入境國(guó)別注意生物安全許可。