細胞凋亡，或稱程序性細胞死亡，是多細胞生物體內維持穩態的關鍵過程，在發育、免疫及疾病（如癌癥、神經退行性疾病）研究中至關重要。區別于被動的細胞壞死，凋亡是一個高度受控的過程，其早期標志性事件是細胞膜磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine， PS）由膜內側翻轉向膜外側。基于這一生物學特征建立的Annexin V檢測法，因其高靈敏度、操作便捷性及與流式細胞術的兼容性，已成為體外鑒定和定量分析凋亡細胞的“金標準”。
在健康細胞中，PS嚴格分布于細胞膜脂質雙層的內側（胞質面）。當細胞啟動凋亡程序時，一種名為“爬行酶”的活性被抑制，另一種“翻轉酶”活性增強，導致PS快速、特異地易位至細胞膜外側。這種暴露是凋亡細胞被巨噬細胞識別和清除的“eat-me”信號，也成為了Annexin V檢測的理想靶點。
Annexin V是一種分子量為35-36 kDa的細胞內蛋白，屬于鈣離子依賴性磷脂結合蛋白家族。在足夠濃度的鈣離子（Ca²?，通常由試劑盒中的結合緩沖液提供）存在下，它能以高親和力、高特異性與PS結合。通過基因工程重組表達并標記熒光基團（如FITC, PE, AF488等），即可將這種結合轉化為可檢測的熒光信號。
僅靠Annexin V單染無法區分早期凋亡細胞和膜已破裂的死細胞（晚期凋亡或壞死細胞），因為后者膜內側的PS也能被Annexin V結合。因此，標準方案采用雙染策略：
膜完整性染料：如碘化丙啶（Propidium Iodide， PI）或7-氨基放線菌素D（7-AAD）。這類染料不能透過完整細胞膜，但可穿過破損的細胞膜與DNA結合，發出紅色熒光。
成功的檢測始于嚴謹的操作。以下是基于流式細胞術的通用流程，關鍵步驟見圖示。
關鍵步驟詳解與優化建議：
細胞準備：
懸浮細胞：直接離心收集，用預冷的PBS輕柔重懸洗滌一次，以去除培養基中的蛋白質（可能干擾結合）。
貼壁細胞：這是最容易引入假陽性的環節。建議：
輕柔吸出培養上清（可能含有已凋亡脫落的細胞），與后續消化下來的細胞合并。
使用不含EDTA的胰酶進行短暫消化（如0.25%胰酶室溫作用1-2分鐘），并在細胞剛要脫落時，立即用含血清的培養基中和終止。EDTA會螯合Ca²?，嚴重影響Annexin V與PS的結合。
有文獻建議，消化后的細胞可在培養基中于37°C恢復培養30分鐘，讓膜表面狀態穩定后再染色，以減少消化應激造成的假陽性。
染色反應：
使用試劑盒專用的1×結合緩沖液重懸細胞。該緩沖液提供了最適的pH、離子強度和關鍵的Ca²?環境。
按照說明書推薦劑量加入熒光標記的Annexin V，避光室溫孵育（通常10-15分鐘）。
孵育結束后、上機前，再加入PI或7-AAD。避免過早加入，以防染料對細胞造成額外損傷。
染色后的樣本建議在1小時內上機檢測，以防細胞狀態發生變化。
對照設置（至關重要）：
空白對照：未染色的細胞，用于調節流式細胞儀的熒光檢測閾值和電壓。
單陽對照：
僅用Annexin V染色的細胞（用于調節PI通道對Annexin V通道的熒光補償）。
僅用PI染色的細胞（用于調節Annexin V通道對PI通道的熒光補償）。
誘導凋亡陽性對照：用已知凋亡誘導劑（如1-10 μM喜樹堿處理2-6小時）處理的細胞，用于驗證實驗體系的有效性。
三、 流式數據深度分析與常見問題
設門與分析：
如圖1所示，在FSC-SSC散點圖中圈出主細胞群，排除碎片。隨后在Annexin V-FITC vs PI散點圖中，根據單陽對照正確設置十字門，即可直接讀取右下象限（早期凋亡）和右上象限（晚期凋亡/壞死）的細胞百分比。
常見問題與解決方案：
早期凋亡細胞比例過低：檢查凋亡誘導條件是否合適；確保染色避光、操作在冰上進行以減緩代謝；驗證結合緩沖液中Ca²?濃度是否充足。
假陽性（Annexin V單陽性細胞過多）：
胰酶消化過度：優化消化時間，改用溫和的細胞刮棒或使用不含EDTA的酶。
細胞洗滌不充分：殘留的EDTA會螯合Ca²?，導致非特異性結合。
Annexin V試劑濃度過高：可嘗試用PBS稀釋Annexin V試劑3-10倍后使用。
假陰性：確認細胞確實發生了凋亡（可平行進行Caspase-3活性檢測）；檢查熒光試劑是否因反復凍融或保存不當而失效；確保檢測設備通道設置正確。
無法區分晚期凋亡與壞死：這是該方法的固有局限。需聯合其他方法，如檢測Caspase活性（凋亡特異）、乳酸脫氫酶釋放（壞死特異），或直接觀察細胞形態學（電鏡）進行綜合判斷。
結論Annexin V凋亡檢測法以其對早期凋亡事件的特異性、操作的標準化以及與高通量分析平臺的兼容性，在生命科學基礎研究與藥物開發（如抗癌藥效評估）中發揮著不可替代的作用。充分理解其“檢測PS外翻”和“依賴膜完整性染料區分”的雙重邏輯，是正確設計實驗、合理解讀數據的根本。通過精心優化細胞處理步驟、嚴謹設置對照、并理性選擇適合的熒光標記組合，研究人員可以最大限度地獲取可靠、可重復的凋亡數據，從而深入揭示細胞命運決定的奧秘。
