在細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域的研究中，細(xì)胞功能檢測(cè)是揭示細(xì)胞生理狀態(tài)、病理機(jī)制及藥物作用效果的核心手段。細(xì)胞周期、增殖、活性、缺氧狀態(tài)、活性氧水平及耗氧率等指標(biāo)，從不同維度反映了細(xì)胞的代謝活性、生長(zhǎng)狀態(tài)及應(yīng)激反應(yīng)。本文將系統(tǒng)梳理這六種關(guān)鍵檢測(cè)技術(shù)的原理、操作要點(diǎn)及應(yīng)用場(chǎng)景，為科研工作者提供全面的技術(shù)參考。?
 

　　一、細(xì)胞周期檢測(cè)?
 

　　細(xì)胞周期是細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，包括 G1 期、S 期、G2 期和 M 期，其進(jìn)程異常與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞分化障礙等疾病密切相關(guān)。?
 

　　(一)檢測(cè)原理?
 

　　常用碘化丙啶(PI)染色法，PI 可嵌入 DNA 雙鏈中，其熒光強(qiáng)度與 DNA 含量成正比。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析熒光信號(hào)，可將處于不同周期時(shí)相的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)：G1 期細(xì)胞含二倍體 DNA，熒光強(qiáng)度呈單峰；S 期細(xì)胞處于 DNA 合成階段，熒光強(qiáng)度介于 G1 期和 G2/M 期之間；G2/M 期細(xì)胞含四倍體 DNA，熒光強(qiáng)度為 G1 期的兩倍。?
 

　　(二)操作要點(diǎn)?
 

　　樣品制備：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用 PBS 洗滌 2 次，加入 70% 冰乙醇固定，4℃孵育過(guò)夜。?
 

　　染色處理：離心去除固定液，PBS 洗滌后，加入 PI 染色液(含 RNase A，避免 RNA 干擾)，室溫避光孵育 30 分鐘。?
 

　　檢測(cè)分析：通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用 ModFit 軟件分析各周期時(shí)相細(xì)胞的比例。?
 

　　(三)應(yīng)用場(chǎng)景?
 

　　主要用于研究細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制、腫瘤細(xì)胞周期阻滯藥物的篩選，以及細(xì)胞分化過(guò)程中周期進(jìn)程的變化。?
 

　　二、細(xì)胞增殖檢測(cè)?
 

　　細(xì)胞增殖檢測(cè)用于評(píng)估細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，是判斷細(xì)胞活力、藥物細(xì)胞毒性及生長(zhǎng)因子作用效果的重要指標(biāo)。?
 

　　(一)常用方法及原理?
 

　　CCK-8 法：CCK-8 試劑中的 WST-8 在細(xì)胞內(nèi)脫氫酶作用下生成橙色甲臜染料，染料產(chǎn)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè) 450nm 處吸光度值，反映細(xì)胞增殖水平。?
 

　　EdU 摻入法：EdU 是胸腺嘧啶類(lèi)似物，可在 S 期摻入新合成的 DNA 中，通過(guò)熒光標(biāo)記的 EdU 抗體檢測(cè)熒光信號(hào)，直接反映處于增殖期的細(xì)胞比例。?
 

　　(二)操作要點(diǎn)?
 

　　CCK-8 法：將細(xì)胞接種于 96 孔板，培養(yǎng)至設(shè)定時(shí)間點(diǎn)，加入 CCK-8 試劑，繼續(xù)孵育 1-4 小時(shí)，檢測(cè)吸光度值。需設(shè)置空白對(duì)照組，排除試劑本身的吸光干擾。?
 

　　EdU 摻入法：細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入 EdU 工作液，孵育 2-24 小時(shí)(根據(jù)細(xì)胞周期調(diào)整)，固定細(xì)胞后進(jìn)行通透處理，加入熒光標(biāo)記抗體孵育，熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀定量。?
 

　　(三)應(yīng)用場(chǎng)景?
 

　　廣泛應(yīng)用于藥物篩選(評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制或促進(jìn)作用)、細(xì)胞毒性檢測(cè)、干細(xì)胞增殖能力評(píng)估等領(lǐng)域。?
 

　　三、細(xì)胞活性檢測(cè)?
 

　　細(xì)胞活性檢測(cè)旨在判斷細(xì)胞的存活狀態(tài)，區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，常用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)處理對(duì)細(xì)胞的損傷程度。?
 

　　(一)核心方法及原理?
 

　　臺(tái)盼藍(lán)染色法：臺(tái)盼藍(lán)是細(xì)胞活性染料，活細(xì)胞細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法進(jìn)入；死細(xì)胞細(xì)胞膜破裂，染料進(jìn)入后使細(xì)胞呈藍(lán)色，通過(guò)顯微鏡計(jì)數(shù)活細(xì)胞與死細(xì)胞比例。?
 

　　鈣黃綠素 - AM / 碘化丙啶(Calcein-AM/PI)雙染色法：Calcein-AM 可被活細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成綠色熒光物質(zhì)，PI 僅能進(jìn)入死細(xì)胞染色 DNA 呈紅色，通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀同時(shí)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。?
 

　　(二)操作要點(diǎn)?
 

　　臺(tái)盼藍(lán)染色法：取細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)染液按比例混合，室溫靜置 5 分鐘，顯微鏡下計(jì)數(shù) 200 個(gè)以上細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞率。?
 

　　雙染色法：細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或 96 孔板，加入染色液孵育 15-30 分鐘，避光條件下觀察熒光信號(hào)，綠色熒光為活細(xì)胞，紅色熒光為死細(xì)胞。?
 

　　(三)應(yīng)用場(chǎng)景?
 

　　適用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的活力監(jiān)測(cè)、藥物或毒素對(duì)細(xì)胞的損傷評(píng)估、細(xì)胞分離純化后的活性檢測(cè)等。?
 

　　四、細(xì)胞缺氧檢測(cè)?
 

　　細(xì)胞缺氧是多種生理和病理過(guò)程中的重要微環(huán)境特征，如腫瘤組織、缺血性疾病病灶等，缺氧檢測(cè)可精準(zhǔn)反映細(xì)胞所處的氧環(huán)境狀態(tài)。?
 

　　(一)檢測(cè)原理?
 

　　采用缺氧特異性探針(如 pimonidazole hydrochloride)，該探針在缺氧條件下(氧分壓 < 10mmHg)可被細(xì)胞內(nèi)的還原酶還原，生成能與細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)合的產(chǎn)物，通過(guò)免疫熒光或免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)合產(chǎn)物，即可標(biāo)記缺氧細(xì)胞。?
 

　　(二)操作要點(diǎn)?
 

　　細(xì)胞水平檢測(cè)：將缺氧探針加入細(xì)胞培養(yǎng)液，在設(shè)定的缺氧條件下培養(yǎng) 2-4 小時(shí)，固定細(xì)胞后進(jìn)行通透處理，加入熒光標(biāo)記的特異性抗體孵育，熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀定量。?
 

　　組織水平檢測(cè)：將探針通過(guò)尾靜脈注射入動(dòng)物體內(nèi)，一段時(shí)間后取目標(biāo)組織，制作石蠟切片，通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)缺氧區(qū)域。?
 

　　(三)應(yīng)用場(chǎng)景?
 

　　主要用于腫瘤微環(huán)境研究、缺血性心臟病及腦卒中的病理機(jī)制探討，以及缺氧靶向藥物的研發(fā)與效果評(píng)估。?
 

　　五、活性氧檢測(cè)?
 

　　活性氧(ROS)是細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的含氧活性物質(zhì)，過(guò)量 ROS 會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，與衰老、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。?
 

　　(一)檢測(cè)原理?
 

　　利用 ROS 特異性熒光探針(如 DCFH-DA、DHE)，探針進(jìn)入細(xì)胞后，被 ROS 氧化生成具有熒光活性的物質(zhì)，熒光強(qiáng)度與 ROS 水平正相關(guān)。DCFH-DA 可檢測(cè)總 ROS，DHE 主要檢測(cè)超氧陰離子。?
 

　　(二)操作要點(diǎn)?
 

　　細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入熒光探針工作液，37℃孵育 20-30 分鐘。?
 

　　用 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，去除未進(jìn)入細(xì)胞的游離探針，加入新鮮培養(yǎng)液，通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度，或用酶標(biāo)儀 / 流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)。?
 

　　(三)應(yīng)用場(chǎng)景?
 

　　適用于氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的機(jī)制研究、抗氧化藥物的篩選與效果評(píng)估、環(huán)境毒素對(duì)細(xì)胞的氧化損傷檢測(cè)等。?
 

　　六、耗氧率檢測(cè)?
 

　　耗氧率是反映細(xì)胞線粒體呼吸功能的核心指標(biāo)，直接體現(xiàn)細(xì)胞的能量代謝水平，對(duì)研究線粒體功能障礙相關(guān)疾病具有重要意義。?
 

　　(一)檢測(cè)原理?
 

　　采用 Seahorse XF 細(xì)胞能量代謝分析儀，該設(shè)備通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中氧氣濃度的實(shí)時(shí)變化，計(jì)算細(xì)胞的耗氧率。儀器配備專(zhuān)用培養(yǎng)板，可在不干擾細(xì)胞培養(yǎng)的情況下進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。?
 

　　(二)操作要點(diǎn)?
 

　　細(xì)胞接種于 Seahorse 專(zhuān)用培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá) 70%-80%，更換為無(wú)血清無(wú)碳酸氫鹽的檢測(cè)培養(yǎng)液，37℃無(wú) CO?環(huán)境下平衡 1 小時(shí)。?
 

　　設(shè)定檢測(cè)程序，加入線粒體呼吸鏈抑制劑(如寡霉素、 FCCP、抗霉素 A 等)，通過(guò)分析抑制劑作用前后的耗氧率變化，區(qū)分基礎(chǔ)耗氧率、ATP 耦合耗氧率及最大耗氧率。?
 

　　(三)應(yīng)用場(chǎng)景?
 

　　常用于線粒體功能評(píng)估、代謝相關(guān)疾病(如糖尿病、肥胖癥)的機(jī)制研究、藥物對(duì)細(xì)胞代謝的調(diào)控作用分析等。